神经细胞黏附分子L1-Ig（1-4）的原核表达及其功能

目的：利用基因克隆、表达、纯化等分子生物学手段获取具有生物活性的神经细胞黏附分子L1（L1）的Ig（1-4）结构域融合蛋白。 方法：实验于2001-10／2004-12在解放军第二军医大学神经生物教研室完成。①从新生4d的SD大鼠的海马组织中提取总RNA，采用反转录-聚合酶链反应法获取L1-Ig（1-4）基因，进行序列分析后构建表达载体pET28a（＋）-LI-Ig（1-4）。②转染大肠杆菌BL21，用IPTG诱导L1-Ig（1-4）的表达。③利用Ni2＋-NTA柱纯化和复性。④用L1-Ig（1-4）融合蛋白观察培养脊髓原代神经元轴突生长情况及其活性，未加入融合蛋白的细胞做对照。 结果：①克隆出编码正确的大鼠L1-Ig（1-4）基因。②并在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物占全菌总蛋白的28-3％。③Ni^2＋-NTA柱纯化后的纯度达90％以上。④加入融合蛋白后脊髓神经元突触的生长能力较未加入融合蛋白的细胞增强[（56&;#177;3．8），（43&;#177;2．7）μm，P〈0．01]。 结论：通过原核表达可大量获得L1-Ig（1-4）融合蛋白，该融合蛋白同样具有促神经生长的生物学活性。     

等距和非等距前交叉韧带重建的对比实验

目的 观察等距和非等距前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)重建对膝关节功能的影响。方法 采用新鲜尸体观察等距ACL的解剖结构，在尸体和模型上重建等距和非等距ACL，分别观察重建后ACL长度和胫骨平台表面压强的变化。结果 等距ACL的重建在膝关节的全范围活动中长度的变化值最小，胫骨平台所受的压强也最小。结论 只有等距的ACI。的重建才能恢复膝关节的正常生理功能，而非等距重建的ACL会造成膝关节的不稳定(或活动受限)，或者使膝关节表面的压强增加。     

颈前路植骨钢板内固定治疗创伤性枢椎前滑移

目的 评价C2、C3椎体间植骨、钢板内固定治疗创伤性枢椎前滑移的临床价值。方法 8例创伤性枢椎前滑移患行颈前路手术复位、椎间盘切除减压、自体髂骨植骨、钢板内固定术，平均随访1年，观察患术后颈椎生理高度、曲度重建和颈椎稳定性、运动情况。结果 8例患均获得完全的枢椎复位，C2、C3椎体在术后16周达到骨性融合，颈椎生理高度、曲度得以重建，旋转、屈伸功能良好，无钢板螺钉并发症。结论 颈前路钢板内固定是治疗创伤性枢椎前滑移的有效方法。     

大鼠脊髓损伤后白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α基因表达的变化

目的 探讨大鼠脊髓损伤后白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达的变化规律。方法SD大鼠42只,随机分为7组,采用改良Allen's脊髓损伤打击模型,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定伤段脊髓组织IL-1β、TNF-αmRNA的表达情况。结果 正常脊髓组织内存在IL-1β、TNF-αmRNA的表达,脊髓损伤后IL-1β、TNF-αmRNA表达迅速增强,在伤后1h达到高峰。结论 IL-1β、TNF-α存在于正常的脊髓组织内,脊髓损伤后IL-1β、TNF-α表达迅速增强,提示协同参与了继发性脊髓损伤过程,并可能是损伤性因素。     

NgR特异性siRNA筛选及其表达载体构建

目的:将siRNA技术应用于NgR,筛选出高效的NgR(Nogo受体)特异性siRNA,并构建其表达载体。方法:2005-03/2006-03,在杭州新瑞佳生物制药有限公司、解放军第二军医大学神经生物教研室设计筛选NgR特异性siRNA,按照E1bashir等设计原则和siRNA的要求,设计、合成4对siRNA,转染体外培养大鼠原代皮层和海马细胞,筛选出基因高沉默效率的NgR特异性siRNA;2004-03/2005-03上海生工生物工程公司将获得的高沉默效率siRNA设计成带有BamHI、HindⅢ酶切粘性末端、终止识别序列和LOOP环的发卡式RNA,并将其克隆入载体pRNAT-U6.1/Neo,构建NgR特异性siRNA表达载体,然后进行酶切鉴定及基因测序。结果:①4对NgR特异siRNA中,siRNA199下调NgRmRNA的表达水平效率最高,转染72h效果最显著(96.04%)。NgR特异性siRNA199序列为:5’-CCGAAUCUCUUACGUGCCATT-3’。②将该序列的发卡式RNA成功克隆入载体pRNAT-U6.1/Neo,构建成NgR特异性siR-NA199表达载体,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。结论:NgR特异性siRNA199及其表达载体构建成功,为进一步合成病毒载体及观察NgR特异性RNA干扰抑制大鼠NgRmRNA表达对脊髓损伤的修复作用奠定了基础。     

兔慢性颈脊髓压迫减压术后凋亡基因bcf-2和bax的表达

目的：通过观察兔慢性颈脊髓压迫症动物模型脊髓减压术后bcl-2和bax的表达，以期了解脊髓减压术治疗慢性颈脊髓压迫症的作用机制。方法：21只患有慢性颈脊髓压迫症的中国大白兔，改良Tarlov运动功能评分均为3分，随机分为两组：①减压组15只：退出螺钉进行减压。其中1只兔发生急性脊髓损伤，改良Tarlov运动功能评分降至1分，排除实验。②压迫组6只：不施行减压术。另取6只无神经功能障碍的健康大白兔作为正常对照组。分别在减压后第1，7，15，30，60天，观察减压术后脊髓的细胞凋亡和凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果：脊髓减压术后凋亡细胞逐渐减少。脊髓减压术后第1天,bcl-2和bax阳性细胞均较减压前增多。减压后第7天，bcl-2阳性细胞明显增多，bax阳性细胞减少。减压后第15，30天和第60天，bcl-2和bax阳性细胞均逐渐减少。至减压后第60天，bcl-2和bax阳性细胞表达与正常对照组相似。结论：脊髓减压术能有效抑制神经细胞凋亡。     

颈前路带锁钢板对单间隙脊髓型颈椎病颈椎曲度及高度的影响

目的 通过对单间隙脊髓型颈椎病颈前路减压植骨融合、使用或不使用颈前路带锁钢板内固定的患者术后随访，分析不同术式对颈椎曲度和高度的影响。方法 对45例单间隙脊髓型颈椎病手术治疗的患者进行随访12-38个月，平均20个月，其中A组行颈前路减压单纯植骨融合20例，B组行颈前路减压植骨融合+颈前路带锁钢板内固定25例，分别在术前、术后1周内、术后2-4个月、术后5-7个月、术后1年以上拍摄颈椎标准侧位片，测量融合节段颈椎前高、后高、颈椎总曲度、融合节段曲度，分析这些参数在手术前后的变化。结果 X线片测量显示，融合节段颈椎前高、后高及节段曲度在术后1周内A、B组在均较术前明显改善，A组分别增加（4.1&;#177;1.6）mm，（2.2&;#177;0.8)mm，（7.1&;#177;5.3)&;#176;，两组间统计学差异无显著性（P&;gt;0.05,t=1.932,1.484,0.420），在术后2-4个月、术后5-7个月及术后1年以上的随访中，A组均有不同程度的丢失，以术后2-4个月尤著，而B组在术后长期随访中无明显丢失，均能较好维持，两组间统计学差异有显著性（P&;lt;0.05,t值为2.435-4.701。颈椎总曲度在术后1周内亦较术前明显改善，A组增加（10.4&;#177;7.7)&;#176;、B组增加（8.1&;#177;3.4)&;#176;，两组间统计差异无显著性（P&;gt;0.05,t=1.364)；在术后2-4个月、术后5-7个月的随访中，A组有逐渐丢失趋势，而B组能较好维持，但两组间统计差异无显著性（P&;gt;0.05,t=0.400,1.330），在术后1年以上随访中，A组回到近于术前水平，而B组仍能较好维持，两组间统计学差异具有显著性（P&;lt;0.05,t=2.814）。结论 对单间隙脊髓型颈椎病行前路减压植骨融合辅以前路带锁钢板内固定，不仅有助于恢复颈椎的生理曲率及椎间高度，并有助于长期维持。     

可调式中空人工椎体治疗脊柱严重粉碎性骨折（附9例报告）

目的：探讨可调式人工椎体治疗椎体严重粉碎性骨折的临床效果。方法：1997年3月－2001年12月间，用可调式中空钛合金人工椎体（AHT－AVB）治疗脊柱严重粉碎性骨折患者9例，T12椎体粉碎性骨折伴截瘫2例，L1椎体粉碎性骨折伴截瘫2例，T12椎体陈旧性压缩骨折伴马尾综合征2例，颈椎骨折伴脱位3例。植骨来源为自体骨／自体骨＋Osteoset人工骨。观察患者手术时间、输血量、手术前后椎节高度、椎节间夹角以及人工椎体稳定性及融合情况等。结果：本组病例全部获得随访，随访时间8－30个月，平均18个月。术中椎节高度基本恢复正常。术中3个月Osteoset人工骨大部份已吸收，椎间隙可见骨融合征象，术后12个月时大多数已形成骨性融合。人工椎体无脱落或移位。神经功能改善8例，无变化1例，无明显并发症出现；结论：对严重粉碎的椎体骨折，无法行自体骨重建者，人工椎体不失为一种选择，但应严格掌握适应证。     

胶质细胞生长因子真核表达载体的构建及其在脊髓内的表达

目的:构建胶质细胞生长因子2真核表达载体pEGFP-N1-GGF2,观察其在大鼠脊髓内的表达。方法:实验于2004-01／10在解放军第二军医大学长征医院神经外科实验室完成。出生1周SD大鼠2只和体质量250-300 g雄性成年SD大鼠12只。将成年大鼠分为对照组和实验组,每组6只。①采用反转录聚合酶链反应方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出胶质细胞生长因子2 的全序列cDNA。②以融合蛋白方式克隆到增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1-GGF2。③采用基因注射法将阳离子脂质体Transfectam和pEGFP-M1-GGF2混合后转染至实验组大鼠胸段脊髓组织中;对照组大鼠只注射脂质体和空白质粒pEGFP-N1的混合物。基因注射后1周,两组各取3只大鼠麻醉后取材行反转录聚合酶链反应,另取3只大鼠麻醉后取出T8,T9脊髓,冰冻切片后行荧光照相,观察绿色荧光蛋白表达情况。结果:12只大鼠均进入结果分析。①大鼠胶质细胞生长因子2 cDNA的克隆结果:成功克隆胶质细胞生长因子2 cDNA。②重组质粒pEGFP- N1-GGF2的构建结果:酶切鉴定及测序分析证实成功构建胶质细胞生长因子真核表达载体pEGFP-N1-GGF2。③反转录聚合酶链反应证明胶质细胞生长因子mRNA表达:实验组基因转染1周后局部脊髓内胶质细胞生长因子2 mRNA的表达显著增加。④pECFP-N1-GGF2基因体内转染结果:实验组注射局部脊髓内灰质和白质神经细胞内均有较多绿色荧光蛋白表达;而对照组未见荧光蛋白表达。结论:阳离子脂质体介导胶质细胞生长因子2基因体内转染的方法是可行的,增强型绿色荧光蛋白可作为报告基因观察胶质细胞生长因子2 基因在体内的表达。     

人腰椎黄韧带Ⅰ和Ⅱ型胶原基因表达随增龄发生软骨骨化的验证：特异性与客观性

目的：运用特异性探针观察不同年龄组黄韧带Ⅰ和Ⅱ型胶原基因表达分布、强度及随增龄而发生的变化，采用客观图像分析验证黄韧带退行性变和骨化增龄性变假说。方法：实验于2003-08／2004-08在第二军医大学长征医院中心实验室完成。21块腰椎黄韧带标本取自椎间盘突出症和椎管狭窄行后路椎板减压术患者，对照组标本取自4例青少年腰椎骨折行后路椎板减压术患者。提供标本患者均知情同意。椎间盘突出症和椎管狭窄患者的腰椎黄韧带标本按年龄分为4组：&;lt;20岁组、20～40岁组、41～60岁组和&;gt;60岁组。用Ⅰ和Ⅱ胶原cDNA探针，对不同年龄组的黄韧带冰冻切片进行原位杂交和图像分析，观察其Ⅰ型胶原表达(成纤维细胞基因表型)和Ⅱ型胶原表达(软骨细胞基因表型)。结果：①原位杂交组织切片观察：&;lt;20岁组黄韧带附着点处和体部纤维细胞排列规则，细胞呈梭形细胞数目较多，有明显的Ⅰ胶原表达，无Ⅱ型胶原表达信号；20～40岁组黄韧带细胞排列尚规则，细胞的数量相对减少，出现轻度纤维化，在黄韧带的附着点处有少量的Ⅰ和Ⅱ型胶原阳性表达信号；41～60岁组黄韧带体部细胞排列不规则，细胞的数量相对减少，出现明显纤维化，黄韧带体部无明显的阳性表达，黄韧带的附着点处有较弱的的Ⅰ型胶原阳性表达，阳性表达细胞分布不均匀，但Ⅱ型胶原的表达较41岁以下组表达增强；&;gt;60岁组黄韧带出现纤维化，未见Ⅰ型胶原阳性表达信号，黄韧带的附着点处Ⅱ型胶原阳性表达信号增强。②Ⅰ型胶原基因表达：&;lt;20岁组、20～40岁组、41～60岁组和&;gt;60岁组均显著高于对照组(1．53&;#177;0．18，1．34&;#177;0．16，0．86&;#177;0．13，0．71&;#177;0．21，0．51&;#177;0．11，P&;lt;0．叭)，随年龄增长表达逐渐减弱(P&;lt;0．05)，但41～60岁组和&;gt;60岁组无显著差异(P&;gt;0．05)。Ⅱ型胶原基因表达：&;lt;20岁组、20～40岁组、41～60岁组和&;gt;60岁组均显著高于对照组(0．73&;#177;0．16，1．14&;#177;0．14，1．46&;#177;0．13，1．65&;#177;0．16，0．53&;#177;0．12，P&;lt;0．01)，随年龄增长表达逐渐增强(P&;lt;0．05)。结论：Ⅰ和Ⅱ型胶原cDNA探针具有高度的特异性，随着年龄的增长，ⅠⅠ型胶原表达逐渐减弱，在附着点处出现Ⅱ型胶原的表达增强，提示成纤维细胞基因表达逐渐减弱，而软骨细胞的基因表达逐渐活跃，为黄韧带退行性变和骨化提供了分子生物学依据。